Циљ предмета:

Циљеви курса Методе у биохемији 2 је да студенти стекну знања о савременим методама које се примењују у рекомбинантној производњи и карактеризацији протеина као и испитивању структуре и биолошке функције биомолекула. Студенти ће кроз експериментални рад да овладају техникама и методама рекомбинантне производње протеина, и њихове структурне односно функционалне карактеризације.

Исход предмета:

Студент је овладао савременим биохемијским техникама које се односе на протеин инжењеринг и испитивање структуре и функције биомолекула.

Садржај предмета:

Теоријска настава

1. Увод у основе рекомбинантне технологије.
2. Дизајнирање протеина. Диригована еволуција протеина. Рационални дизајн протеина.
3. ПЦР. РТ ПЦР. Квантитативни ПЦР.
4. Припрема цДНА библиотека.
5. Хетеролога производња протеина у прокариотском систему.
6. Хетеролога производња протеина и еукариотским системима: биљке.
7. Хетеролога производња протеина и еукариотским системима: квасци.
8. Савремене технике у структурној и функционалној карактеризацији протеина: примарне, секундарне, терцијарне, кватернарне структуре.
9. Основи гликобиологије. Посттранслационе модификације протеина.
10. Протеомикс. Геномикс. Метаболомикс. ДНK micro array.

Практична настава

Вежбе су конципиране да студент добије пројекат који треба да реализује кроз експериментални рад примењујући знања стечена на курсу Методе у биохемији 1.

1. Дизајн прајмера за ПЦР. Изоловање геномске, и тоталне РНК из полазног материјала. Одређивање концентрације РНК, сДНК, дсДНК. Умножавање гена полимераза ланчаном реакцијом. Анализа производа добијеног полимераза ланчаном реакцијом агарозном електрофорезом.
2. Умножавање експресионог вектора у Е. коли, изоловање и обрада рестрикционим ендонуклеазама. Изоловање линеаризованог вектора из агарозног гела након електрофорезе, одређивање концентрације. Лигација ПЦР производа у експресиони вектор.
3. Трансформација Е. коли. Селекција позитивних клонова помоћу полимераза ланчане реакције. Изоловање плазмида, сечење рестрикционим ендонуклеазама, и електрофоретска анализа.
4. Оптимизација услова експресије рекомбинантног протеина. Провера позитивних клонова СДС ПАА електрофорезом и имуноблотом.
5. Оптимизација протокола изоловања рекомбинантног протеина употребом афинитетног матрикса и класичних хроматографских метода. Увијање протеина на колони и у раствору. Провера степена пречишћавања СДС ПАА електрофорезом.
6. Структурна и функционална карактеризација рекомбинантног протеина.

Ваннаставне активности

Припрема пројекта који ће студент практично урадити на вежбама, уз преглед научне литературе за дати протеин односно протеинску фамилију.

Литература:

1. S. Primrose, R. Twyman, R. Old: Principles of Gene Manipulation

Помоћна литература

1. K. Wilson and J. Walker: Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology

Методе извођења наставе:

Предавања,експерименталне вежбе, туторијал, уз обавезну презентацију својих резултата у форми научног рада. Јавна одбрана, уз коришћење модерних помагала (ППТ формат).