Циљ предмета:

Курс је намењен студентима који желе да стекну знања и практичну обуку за рад на инструментима који се користе у биохемији за одређивање структуре и модификација протеина и испитивања интеракција лиганда и макромакромолекула (протеина и ДНА).

Исход предмета:

Студент је оспособљен да примењује модерне инструменталне методе за одређивање структуре протеина и испитивања интеракција лиганда и макромолекула.

Садржај предмета:

Теоријска настава

1. Преглед модерних инструменталних метода у бихемији: спектрофлуориметрија, ЦД спектроскопија, микрокалориметрија, ФТИР, СПР, масена спектрометрија.
2. Технике протеомикса и метаболомикса.
3. Примена флуоресцентне спектроскопије у биохемији. Природне флурофоре у протеинима. Утицај околине у протеинима на емисију триптофана. Примена спектрофлуриметрије за одређивање интеракција протеина и лиганда. Метода гашења флуоресценце триптофана. Терцијарна структура и флуроресенција протеина.
4. - Дефиниција циркуларног дихроизма у биохемији, појам секундарне и терцијарне структуре протеина; одређивање конформације протеина и нуклеинских киселина; утврђивање конформационих промена током протеин-протеин, протеин-лиганд, протеин-ДНК, ДНК-лиганд интеракција.
   - Одређивање везивних константи методама: директне титрације, серијским разблажењем комплекса, промене стабилности током хемисјке и термалне денатурације.
5. Анализа ЦД спектара помоћу: софтвера Спектар менаџер, одређивање секундарне структуре у протеинима употребом ЦД Про софтвера.
6. - Методе масене спекрометрије у протеомици.
   - Методе које могу да се куплују са масеном спектрометријом при раду у протеомици: течна хроматографија (ХПЛЦ) на нано скали, капиларна електрофореза, дводимензионална електрофореза.
   - Припрема узорка за масену спектрометрију. "Bottom up proteomics": идентификација и карактеризација протеина методом "Пептидног мапирања", de novo секвенцирање, анализа пост-транслационих модификација (хидроксилација, фосфорилација), мапирање дисулфида, квантификација протеина (методама SILAC, iTRAQ, label-free квантификација), анализа мултипротеинских комплекса и ћелијских органела. Имунопротеомикс. "Top down protomics": одређивање егзактне масе протеина и пептида, анализа пост-транслационих модификација (гликозилација,фосфорилација).
   - Анализа масених спектара уз помоћ софтвера и алгоритама: Mascot, Sequest, Profound, X!tandem, MassMatrix, ProSight.
   - Примена масене спектрометрије за квантификацију протеина у комплексним узорцима и биолошким флуидима.
7. Методе масене спектрометрије у метаболомици. Анализа малих молекула. Метаболичке модификације малих молекула. Примена метаболомике у фармакодинамским испитивањима.

Практична настава

1. Снимање флуоресцентних спектара протеина.
2. Одређивање константе везивања ретинола за бета- лактоглобулин.
3. Одређивање константи везивања одабраних полифенола за бета-лактоглобулин методом гашења флуоресценце триптофана.
4. Одређивање тачке топљења протеина спетрофлуориметријском методом: припрема и карактеризација И, С и Н форми овалбумина спетрофлуриметријом и ЦД спектроскопијом.
5. Снимање протеинских ЦД спектара и одређивање садржаја секундарних структура у протеинима.
6. Праћење конформационих промена протеина приликом термалне денатурације ЦД спектроскопијом.
7. Праћење конформационих промена протеина денатурације хаотропним агенсом ЦД спектроскопијом.
8. Одређивање егкзактне масе протеина масеном спектрометријом.
9. Пептидно мапирање (ПМФ) протеина и протеомикс
   - редукција и алкилација узорка у раствору;
   - припрема узорака за ПМФ након 2Д електрофорезе;
   - дигестија ендопротеиназама;
   - хроматографско раздвајање пептида на нано реверзно-фазној хроматографији и анализа пептида помоћу LTQ Obritrap XL масеног спектрометра;
   - анализа масених спектара уз помоћ софтвера и алгоритама: Mascot, Sequest, X!tandem, Profound, MassMatrix, ProSight.
10. Одређивање пост-траслационих модификација протеина.
    - Хидроксилација и фосфорилација.
    - Одређивање положаја дисулфидних мостова у протеинима.
11. Квантитативна протеомика - одређивање концентрације протеина у смеши.
    - Релативна и апсолутна квантификација.
    - Употреба програма Skyline.

Литература:

• J. R. Lakowicz: Principles of Fluorescence Spectroscopy, Springer 2006.
• Ј. Throck Watson, O. D. Sparkman: Introduction to mass spectrometry, Wiley 2007.
• G. D. Fasman: Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules, Springer, 1996.
• Nina Berova, Koji Nakanishi, Robert W. Woody: Circular Dichroism: Principles and Applications, Wiley, 2000.
• J. Lovric: Introducing Proteomics: From concepts to sample separation, mass spectrometry and data analysis, Wiley, 2011.
• Материјали са предавања и вежби

Методе извођења наставе:

Предавања, лабораторијске вежбе, колоквијуми, семинарски рад.